El 13 de junio de 1553 llegaron de Asunción, de paso para Europa, el tudesco Ulrico Schmieder y el caballero genovés Francisco Gambarotta, que volvía a la metrópoli con algunas comunicaciones para el Consejo de Indias. Aprovechando la oportunidad que se presentaba, encargó a Gambarotta la misión de llevar a España la noticia de los desastres sufridos por la armada de Sanabria y del atropello y detención arbitraria que sufrían en San Vicente. Llevaba también a España, por encargo de Salazar, muestras de “cierto metal blanco” que aquél y sus acompañantes habían hallado en la provincia, doce leguas de Asunción, pocos meses atrás. A fines de junio Gambarotta se dirigió a España y cumplió sin duda su encargo sin tardanza. Más cuando la carta de Salazar de que era conductor llegó al Consejo de Indias, don Diego de Sanabria no era ya gobernador y adelantado del Río de la Plata. La Corte había designado a Irala gobernador del Río de la Plata, en la real cédula del 4 de noviembre de 1552. La trajo en copia, por vía San Vicente, Bartolomé Giustinian o Justiniano, que, tras larga demora en esta ciudad, llegó por fin a la Asunción en agosto de 1555.
En ese año navegaba ya rumbo al río de la Plata la armada de Orúe. Casi tres años habían durado los preparativos, al cabo de los cuales abandonó las costas españolas de Sanlúcar de Barrameda, en agosto de aquel año. Transcurrió el viaje sin inconveniente alguno, y el miércoles de ceniza 1° de abril de 1556, ausente Irala, aportó a la Asunción.
Pocas semanas después llegaron también a esta ciudad Hernando de Trejo, doña Mencía y los náufragos que quedaban, los cuales habían permanecido en San Francisco a la espera de don Diego hasta marzo o abril de 1555. Sus esperanzas se habían desvanecido con la llegada de Justiniano a San Vicente; por él supieron sin duda de la nueva provisión que nombraba gobernador a Irala. Los últimos meses de la residencia de aquéllos en San Francisco habían sido harto penosos, por falta de víveres y recursos para conseguirlos. Irala pidió a Hernando de Trejo la razón de haber desamparado San Francisco; y no dándole bastante satisfacción, “le prendió y tuvo privado de libertad hasta tanto que de todo hubiese mandato y disposición de su majestad” (R. Díaz de Guzmán). Así concluyó la penosa vía crucis de los náufragos de Sanabria, mucho más desgraciada que para ellos, para los intereses y el porvenir de la dominación colonial de España en el Río de la Plata.
Hasta 1555, Irala vivió en constante alarma y como sobre aviso, temeroso de ser sorprendido y preso por algún enviado de la Corte. Poco tiempo antes de la llegada de Orúe, al saber por vía de indios y lenguaraces la inminente llegada de aquél, salió de Asunción, probablemente para huir al Brasil, con escolta de 30 soldados. Seguro ahora de su autoridad por el nombramiento real que en copia le habla traído Giustinian, repartió a extranjeros franceses, ingleses, portugueses y genovés a imprimir a la Asunción aquel sello cuya inopinada y precaria fortuna, debida sólo al favor para éste prenda casi cierta de fidelidad. No escapaba, como es fácil imaginar, a la penetración de aquel “la grande importancia que había en tener poblado un puerto para escala de los navíos en la entrada del Río de la Plata”(R. Díaz de Guzmán). A este propósito había respondido, en 1552, la tentativa de poblar a orillas del río San Juan, realizada por el capitán Juan Romero, con poco más de 100 soldados y dos bergantines, auxiliada poco después, para repeler un ataque de los indios comarcanos, con un refuerzo de sesenta, bajo el mando de Alonso Riquelme, ya la cual el mismo Irala se refiere, probablemente, en su carta de 1555, aludiendo al segundo socio que había enviado a los compañeros de Sanabria, por febrero de aquel año. No se le ocultaban tampoco las graves dificultades de tal empresa con los limitados recursos de hombres, armas y bastimentos de que disponía y la lentitud agobiadora y los grandes riesgos de la navegación aguas arriba por el río Paraná. Prefirió, pues, acometer con todas sus fuerzas la ocupación de la provincia de Guayrá, y de todo el territorio comprendido entre el alto Paraná y la costa del Brasil, que ya asolaban los portugueses, aliados a los indios tupís, con sus crueles malocas, mediante las cuales arreaban como bestias miles de infelices indios guaraníes y les llevaban cautivos a trabajar como esclavos en San Vicente.
Con este fin, accediendo a un pedido de ciertos caciques de Guayrá, realizó su entrada a esta provincia en 1555. Ese mismo fin tuvieron: la fundación de Ontiveros, encomendada en el mismo año, probablemente, al capitán García Rodríguez de Vergara, con 6o soldados; la lucha del sucesor de aquél, capitán Pedro de Segura, contra el aventurero inglés Nicolás Colman, manco de cierta nombradía, “el más determinado y colérico soldado de cuantos allí había”, según Ruy Díaz de Guzmán, en 1556, y la fundación de Ciudad Real, realización de un pro pósito de Irala que, después de su muerte, ocurrida en Asunción d 3 de octubre de 1556, encomendó el sucesor de aquél, Gonzalo de Mendoza, al capitán Ruy Díaz de Melgarejo, padre del cronista Díaz Guzmán, con 1oo soldados. La nueva población se asentó tres leguas arriba del Salto Grande, junto a Ontiveros, sobre la margen izquierda del río Paraná, en la confluencia del Pequirí.
Las quejas y lamentaciones infructuosas de los náufragos de Sanabria y las observaciones y advertencias del piloto Juan Sánchez de Vizcaya, documentadas en su petición de 1545, y años después en su excelente carta descripción de 1553-1556, eco lejano de la política colonial de Irala y sus parciales, fueron, en el siglo xvi, las únicas tentativas española dirigidas a contener las usurpaciones territoriales de los portugueses, cuyas consecuencias desastrosas para el imperio colonial de España en América del Sur se harían sentir, ya irremediablemente, siglo y cuarto después, en 1680, con un nuevo y audaz avance: la fundación de la Colonia del Sacramento.